Как выбрать правильную технологию секвенирования?

Cегодня используются два основных типа технологий секвенирования: секвенирование по Сэнгеру и секвенирование следующего поколения (NGS). Секвенирование по Сэнгеру основано на методе обрыва цепи, в котором используются радиоактивно меченные, химически модифицированные аналоги четырех нуклеотидных оснований (A, T, G и C). Аналоги называются дидезоксинуклеотидами (ddNTP), поскольку в них отсутствует гидроксильная группа, необходимая для удлинения цепи. После включения аналога цепь заканчивается на A, T, G или C, и последовательность разрешается с помощью капиллярного электрофореза (КЭ). Технология секвенирования по Сэенгеру использует капиллярный электрофорез для создания секвенирующих чтений длиной >500 нуклеотидов. В отличие от этого, NGS - это метод массивно-параллельного секвенирования, способный генерировать сотни миллионов более коротких прочтений одновременно. И секвенирование по Сэнгеру, и NGS имеют быстрое время выполнения, и оба метода полезны в области генетического анализа.

Выбор технологии секвенирования зависит от исследовательских вопросов и целей проекта, которые помогут определить требования к пропускной способности, длине чтения и точности, а также от имеющихся типов образцов. Обратите внимание, что выбор не является взаимоисключающим; поскольку секвенирование по Сэнгеру с помощью КЭ остается золотым стандартом для приложений, связанных с определением последовательностей, где точность имеет решающее значение, оно часто используется в качестве ортогонального метода для проверки вариантов, обнаруженных с помощью NGS. Например, при изучении генетических заболеваний человека выбор технологии зависит от уровня наблюдаемой фенотипической гетерогенности: Секвенирование по Сэнгеру может быть выбрано для генерации чтений размером до 1 000 п.н. и анализа одного или двух генов при заболевании с четко определенным фенотипом или для подтверждения вариантов NGS. NGS может быть выбран для обнаружения новых вариантов при заболеваниях с более высоким уровнем фенотипической гетерогенности путем секвенирования большего числа генов. Это связано с тем, что NGS позволяет одновременно исследовать от сотен до тысяч генов в нескольких образцах, а также обнаруживать и анализировать различные типы геномных особенностей в ходе одного цикла секвенирования, от одиночных нуклеотидных вариантов (SNV) до вариантов числа копий и структурных вариантов, и даже слияний РНК.

Замечание о фрагментном анализе

Приборы капиллярного электрофореза способны выполнять как секвенирование по Сэнгеру, так и фрагментный анализ; фрагментный анализ включает в себя ряд методов, в которых фрагменты ДНК флуоресцентно мечены, разделены с помощью КЭ и определены по размеру путем сравнения с внутренним стандартом. Хотя секвенирование ДНК с помощью КЭ используется для определения конкретной последовательности оснований определенного фрагмента или сегмента гена, этот метод также может предоставить информацию о размерах, относительном количестве и генотипировании для флуоресцентно меченых фрагментов ДНК, полученных с помощью ПЦР с использованием праймеров, предназначенных для конкретной ДНК-мишени.

Анализ фрагментов ДНК позволяет решать множество задач, включая аутентификацию клеточных линий, определение эффективности редактирования CRISPR-Cas9, анализ микросателлитных маркеров, мультиплексный анализ лиганд-зависимой амплификации зондов (MLPA), относительную флуоресцентную количественную оценку или количественную флуоресцентную ПЦР (QF-PCR), генотипирование SNP, выявление анеуплоидии и многое другое. Хотя технологии секвенирования также позволяют применять эти методы, исследователи выбирают фрагментный анализ, поскольку он имеет более быстрое время выполнения, более высокую чувствительность и более высокое разрешение. Он также более экономичен благодаря возможности мультиплексирования; аллели перекрывающихся локусов различаются путем маркировки праймеров, специфичных для локусов, разными красителями. Благодаря этой способности фрагментный анализ позволяет исследовать более 20 локусов в одной реакции.

Резюме

Секвенирование по Сэнгеру, NGS и фрагментный анализ позволяют применять их в самых разных областях исследований. Однако в зависимости от требований проекта один метод может быть предпочтительнее другого. Секвенирование по методу Сэнгера идеально подходит для небольших проектов, сфокусированных на одном или двух генах, в то время как NGS идеально подходит для более высокопроизводительного секвенирования. Хотя фрагментный анализ не дает информации о последовательности, он может быть использован для получения информации об относительной количественной оценке экономически эффективным способом благодаря возможности мультиплексирования.